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硝基咪唑类药物残留分析技术——提取方法

时间:2023-03-24 23:44:08来源:food栏目:食品快速检测 阅读:

 

硝基咪唑类药物残留分析技术——提取方法

[db:作者] / 2022-12-21 00:00

16.1.4 残留分析技术

硝基咪唑类药物残留受到各国政府的关注,其残留检测方法研究较多,目前主要采用仪器分析方法。Polzer等8确定了火鸡服用硝基咪唑类药物后应该检测的目标化合物。比较了MNZ、RNZ、DMZ、IPZ及其相应的羟基化代谢产物MNZOH、HMMNI、IPZOH在火鸡各组织中的含量及稳定性。检测MNZ和RNZ时应该选择原药作目标化合物;在检测DMZ和IPZ时,应选择其代谢产物HMMNI和IPZOH作为目标化合物。

16.1.4.1 前处理方法

前处理中往往涉及浓缩吹干等步骤,本类药物蒸汽压较高,易被溶剂或气流带出损失,所以蒸发温度不宜过高,吹蒸速度不宜过快,不要将样品蒸干,应缓缓吹入氮气或空气。

(1)提取方法

提取是将生物样品中的残留药物通过适宜的溶剂转移出来,并尽量减少共萃取的样品基质。样品基质中硝基咪唑类药物及其羟基代谢物在常温下降解迅速,视网膜和血浆中样品稳定性比肌肉和肝脏中高,合理的方法还应该保证分析物的稳定性。早期研究将样品调节pH3,用蛋白酶过夜酶解提取与组织蛋白结合的残留物,但近期研究表明没必要酶解。

1)液液萃取(liquid liquid extraction,LLE)

由于该类药物的碱性性质,在酸性条件下溶于水,在碱性条件下溶于有机溶剂,组织提取物用酸性水溶液复溶后,可用二氯甲烷或正己烷除脂。硝基咪唑类药物的提取用乙酸乙酯、乙腈、二氯甲烷和甲苯等,溶剂极性不同,共萃取的杂质也不同,后续净化方法也不相同。其中应用乙腈和乙酸乙酯的报道最多,禽蛋类样品应用乙腈提取比乙酸乙酯更好,可以避免乳化现象。提取溶剂常加入适量的盐可促使溶剂与样品基质相分离,减少和沉淀共萃取物,其中氯化钠应用最多。提取液常用氮气吹至近干,该步骤很关键,因为过热和干燥可能导致分析物挥发。乙酸乙酯沸点相对较低,加入少量的高沸点溶剂如二甘醇(沸点241℃)作为保持剂,可防止因蒸发温度过高引起药物挥发损失。

A. 乙腈提取

乙腈沉淀蛋白效果较好,与水性基质互溶,是提取组织中硝基咪唑类药物常用溶剂之一。乙腈用于提取禽肉类样品,回收率在79%~93%之间。Wang等用乙腈提取禽肉中MNZ、DMZ和RNZ,回收率在80%~90%之间,变异系数(CV)小于14.3%。Thompson等用乙腈提取动物肾脏、肝脏、牛奶和禽蛋中6种硝基咪唑及其代谢物,经免疫传感器测定,DMZ、RNZ、IPZ的检测能力(CCβ)小于1μg/kg,DMZOH、IPZOH的CCβ小于3μg/kg,MNZ和MNZOH的CCβ小于2μg/kg,但未测定回收率。Cronly等用液相色谱-质谱(LC-MS)测定了牛奶和蜂蜜中的CNZ、TNZ、TIZ、ORZ、RNZ、DMZ、MNZ、IPZ、IPZOH、HMMNI和MNZOH。3g蜂蜜加5mL水,完全溶解混匀后,加10mL乙腈、2g氯化钠,振摇,离心,上清液用正己烷脱脂后测定;1mL牛奶用2mL乙腈、0.5g氯化钠提取,振荡离心后取上清液测定。以HMMNI-d3、MNZOH-d2、DMZ-d3、RNZ-d3作为内标定量。牛奶的回收率为90.8%~108.9%,检测限(CCa)和CCβ分别为0.41~1.55μg/L和0.70~2.64μg/L;蜂蜜中CCa和CCβ分别为0.38~1.16ug/kg和0.66~1.98ug/kg。

B. 乙酸乙酯提取

乙酸乙酯与组织也有一定相溶性,适用于提取中等极性药物,很多研究采用乙酸乙酯提取组织中硝基咪唑类药物,但需要注意的是乙酸乙酯提取液中往往含有较多的脂肪,脱脂净化步骤必不可少。Sun等用乙酸乙酯提取禽和猪肉中7种硝基咪唑(包括MNZ、RNZ、DMZ、TNZ、ORZ、SNZ以及RNZ和DMZ的共同代谢物HMMNI)。7种硝基咪唑类药物检测限(LOD)为0.2μg/kg,鸡肉、猪肉中药物回收率为71.4%~99.5%,CV分别为6.2%~13.9%和4.0%~8.7%。Zeleny等直接用乙酸乙酯提取猪肉中DMZ、MNZ、RNZ、MNZOH、IPZOH和HMMNI,提取液上清液蒸干后流动相复溶,进LC-MS测定,回收率为101%~107%,CCa和CCβ分别为0.29~0.44μg/kg和0.36~0.54μg/kg。黎翠玉等采用乙酸乙酯提取动物源食品中MNZ、DMZ和RNZ及其代谢物MNZOH、HMMN残留,LC-MS测定。方法回收率在61.1%~108.0%之间,相对标准偏差(RSD)为1.9%~6.3%,定量限(LOQ)为0.1μg/kg。Zhou等报道用乙酸乙酯提取蜂蜜中MNZ、RNZ、DMZ、TNZ和HMMNI的残留。MNZ、DMZ、RNZ、TNZ和HMMNI的LOD为1.0~2.0ng/g,平均回收率为71.5%~101.4%。刘玉芳等建立了高效液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)测定盐渍羊肠衣中2种硝基咪唑残留量。先用甲醇-丙酮均质,以乙酸乙酯萃取提取盐渍羊肠衣中硝基咪唑类残留物。测定出甲硝唑和洛硝哒唑的LOD均为0.5ng/mg,甲硝唑和洛硝哒唑的LOQ均为1.0ng/mg;在添加水平0.5ng/mg、1.0ng/mg、2.0ng/mg的回收率为62.7%~70.37%,RSD为3.4%~5.8%。在碱性条件下,本类药物以分子形态存在,易溶于有机溶剂,乙酸乙酯的提取效率提高。Sakamoto等提取鱼肉中MNZ、DMZ和RNZ残留。5g组织加入1g碳酸氢钠后用乙酸乙酯提取,LC-MS/MS测定。回收率为91.2%~107.0%,LOD为0.05~0.2μg/kg。丁涛等用4mL 0.25mol/L氢氧化钠溶液-乙酸乙酯将蜂王浆中MNZ、DMZ和RNZ提取至乙酸乙酯相。DMZ的LOQ为2.0μg/kg,MNZ和RNZ为1.0μg/kg;回收率和CV分别为96.6%~110.6%和2.1%~7.4%。

C. 二氯甲烷提取

二氯甲烷与乙酸乙酯化学性质相似,但二氯甲烷密度较大,提取完成离心后基质浮在提取液上方,后续操作应尽量减少二次污染。用二氯甲烷提取时加入无水硫酸钠可以吸去组织中的水分,使组织密度升高,离心时可以完全沉淀到试管底部,有利于后续操作;同时,硫酸钠盐析也可提高提取效率。Cannavan等根据基质特点,分别用二氯甲烷提取肌肉中的DMZ,用甲苯提取肝脏和禽蛋中DMZ。用D-DMZ内标,回收率为93%~102%,CV为1.2%~7.7%,绝对回收率接近80%,但甲苯对MNZOH的提取效率很低。高小龙用无水硫酸钠和二氯甲烷振荡提取鸡组织(肌肉、肝脏、肾脏、脂肪)中的MNZ和DMZ残留。组织中DMZ及DMZOH的LOQ均为1.0μg/kg;肌肉平均回收率在56.9%~76.5%之间,肝脏在63.3%~72.6%之间,肾脏在64.2%~73.3%之间,脂肪在63.5%~75.7%之间;日内CV均小于16%,日间CV均小于15%。

D. 其他溶剂提取

也有采用其他溶剂提取的报道。GB/T21318-2007测定猪肉、鸡肉、牛肉、猪肝、鸡肝、牛肝、猪肾、牛肾和鱼肉中4-硝基咪唑、IPZ、MNZ、RNZ、MNZ、CMNI、DMZ、苯硝咪唑及其代谢物MNZOH、HMMNI时,样品用硅藻土混匀,加饱和氯化钠、甲醇-丙酮(3+1,v/v),再均质提取3min,离心后取上层液,LC-MS/MS测定。LOD达到0.5~1μg/kg,回收率为71.4%~115%。该提取过程类似于QuEChERS,相对较为简单。Semneiku等测定鸡血中的MNZ和DMZ残留,取1mL血清并加入20%的三氯乙酸甲醇溶液1mL,混合后离心,取上清液过滤膜后用高效液相色谱(HPLC)分析。血清中LOD为5ng/mL,回收率为82%~94%,CV小于10%。

2)超声辅助萃取(ultrasonic-assisted extraction,UAE)

UAE是利用超声波辐射压强产生的强烈空化效应、机械振动、扰动效应、高加速度、乳化、扩散、击碎和搅拌作用等多级效应,增大物质分子运动频率和速度,增加溶剂穿透力,从而加速目标成分进入溶剂,促进提取的方法。UAE适用于匀浆的组织和结构松散的样品(如蜂蜜、牛奶)。GB/T21318-2007测定奶粉和蜂蜜中的4-硝基咪唑、IPZ、2-甲硝唑、RNZ、MNZ、CMNI、DMZ、苯硝咪唑残留及其代谢物MNZOH、HMMNI时,用10mL饱和氯化钠水溶液和70mL甲醇-丙酮(3+1,v/v)超声波辅助提取30min,离心后取上层液体,经固相萃取净化,LC-MS/MS测定,LOD达到0.5~1μg/kg,回收率为71.4%~115%。

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