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液相色谱-串联质谱法测定牛肝和牛肉中睾酮、表睾酮、孕酮残留量

时间:2023-03-25 04:42:54来源:food栏目:食品快速检测 阅读:

 

液相色谱-串联质谱法测定牛肝和牛肉中睾酮、表睾酮、孕酮残留量

[db:作者] / 2022-12-13 00:00

8.2.1.1 适用范围

适用于牛肝和牛肉中睾酮、表睾酮、孕酮残留量的液相色谱-串联质谱测定。方法检出限:肝脏中睾酮、表睾酮、孕酮为0.5mg/kg,肌肉中睾酮、表睾酮为0.1mg/kg,孕酮为0.5mg/kg。

8.2.1.2 方法原理

牛肝和牛肉中的睾酮、表睾酮、孕酮药物残留经酶解后用甲醇叔丁基甲醚提取,提取液用C18固相萃取柱净化,肝脏样品需再经硅胶固相萃取柱净化,洗脱液浓缩定容后,供液相色谱-串联质谱测定。

8.2.1.3 试剂和材料

乙腈、甲醇、叔丁基甲醚、正已烷:色谱纯;三氯甲烷、甲酸铵:分析纯。

β-葡糖苷酸酶/硫酸酯酶:H-2型,Helixpomatia。磷酸盐缓冲液:1.0mol/L。称取13.6g磷酸二氢钾溶于100mL水中,称取8.7g磷酸氢二钾溶于50mL水中,分别取70mL磷酸二氢钾水溶液和28mL磷酸氢二钾水溶液,混匀后调节pH为5.0,置4℃中可保存1周。饱和氯化钠水溶液。水饱和乙酸乙酯。

睾酮、表睾酮、孕酮标准物质:纯度≥99%。氘代睾酮(d5-睾酮)、氘代孕酮(d9-孕酮)内标标准物质:纯度≥98%。

标准储备溶液:100μg/mL。准确称取适量的睾酮、表睾酮、孕酮标准物质,用甲醇分别配制成100μg/mL的标准储备溶液,-18℃贮存,可使用6个月。

标准工作溶液:5μg/mL。分别吸取5mL睾酮、表睾酮、孕酮标准储备溶液至100mL容量瓶中,以甲醇稀释并定容,此标准工作溶液的浓度为5μg/mL。-18℃贮存,可使用6个月。

混合标准工作溶液:50ug/L。分别吸取1.00mL睾酮、表睾酮、孕酮标准工作液至100mL容量瓶中,以甲醇稀释并定容,此混合工作溶液的浓度为50μg/L。-18℃贮存,可使用3个月。

内标储备溶液:100μg/mL。准确称取适量的氘代睾酮(ds-睾酮)、氘代孕酮(d9-孕酮)标准品,用甲醇分别配制成100μg/mL的内标储备溶液,-18℃贮存,可使用6个月。

内标工作溶液:5μg/mL。分别吸取5mL氘代睾酮(d5-睾酮)、氘代孕酮(d9-孕酮)内标储备溶液至100mL容量瓶中,以甲醇稀释并定容。-18℃贮存,可使用6个月。

内标混合工作溶液:25μg/L。分别吸取0.50mL氘代睾酮(d5-睾酮)、氘代孕酮(d9-孕酮)内标工作溶液至100mL容量瓶中,以甲醇稀释并定容。-18℃贮存,可使用3个月。

基质混合标准工作溶液:根据每种标准的灵敏度和仪器线性范围,吸取一定量的混合标准工作溶液和内标工作溶液,用空白样品提取液配成系列浓度的基质混合标准工作溶液。当天配制。

C18固相萃取柱:500mg,6mL。使用前依次用6mL甲醇、6mL水活化。硅胶固相萃取柱:200mg,6mL。使用前用6mL正已烷活化。

8.2.1.4 仪器和设备

液相色谱-串联质谱仪,配有电喷雾离子源;分析天平:感量0.1mg和0.01g;匀质机;高速组织匀浆机;低温高速离心机:转速大于4000r/min;高速离心机:转速大于12000r/min;超声波;旋涡振荡器;振荡水浴;氮气浓缩仪;固相萃取装置;旋转蒸发器;KD浓缩瓶。

8.2.1.5 样品前处理

(1)试样制备

取样品约500g用组织捣碎机捣碎,装入洁净容器作为试样,密封,并标明标记。将试样于-18℃保存。

(2)酶解

准确称取5g试样,准确至0.01g,置于50mL离心管中,依次加入200μL内标混合工作溶液、10mL磷酸缓冲液,以14000r/min均质30s,加入60μL葡萄糖苷酸酶/硫酸酯酶,混匀30s,置于37℃恒温振荡水浴中酶解16h。

(3)提取

酶解后的样品溶液加10mL甲醇,混匀2min,置冰浴中放置5min,在5℃以4000r/min离心10min,上清液转移至50mL离心管中,下层沉淀再用5mL甲醇重复上述操作一次,合并上清液至上述50mL离心管中,向离心管中加入15mL叔丁基甲醚,振摇5min,以4000r/min离心5min,上层溶液转移至125mL分液漏斗中,下层溶液依次再用15mL、10mL叔丁基甲醚提取二次,合并上层溶液至上述分液漏斗中,加入10mL饱和氯化钠水溶液,振摇30s,静置分层,上层溶液转移至梨形瓶中,在40℃旋转蒸发至干,残渣中加入1.5mL甲醇,涡旋1min,超声5min,再加入20mL水,混匀,待净化。

(4)净化

将样品提取液转移至已活化的C18固相萃取柱上,用5mL水洗涤梨形瓶,洗涤液合并至C18固相萃取柱中,以≤2mL/min流速使样液通过固相萃取柱,待样液过柱后,用5mL水淋洗C18固相萃取柱,弃去淋洗液,用10mL甲醇将待测组分从C18固相萃取柱.上洗脱,洗脱液转移至梨形瓶中,在40℃旋转蒸发至干。肌肉样品用0.5mL甲醇溶解残渣,涡旋1min,加入0.5mL水混匀,过0.2um滤膜,供液相色谱串联质谱测定。

肝脏样品的洗脱液蒸干后,向梨形瓶中加入0.5mL三氯甲烷,涡旋1min,加入5mL正己烷,超声1min,然后转移至已活化的硅胶固相萃取柱中,以1mL/min流速使样液通过固相萃取柱,待样液过柱后,用5mL正己烷淋洗硅胶固相萃取柱,弃去淋洗液,用6mL水饱和乙酸乙酯洗脱待测组分,洗脱液转移至KD接收瓶中,在40℃旋转蒸发至干,加0.5mL甲醇,涡旋1min,加入0.5mL水混匀,过0.2um滤膜,供液相色谱一串联质谱测定。

称取阴性样品,按上述提取净化步骤制备空白样品提取液,用于配制系列基质混合标准工作溶液。

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