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甾类同化激素类药物残留分析技术测定方法(一)

时间:2023-03-25 04:17:20来源:food栏目:食品快速检测 阅读:

 

甾类同化激素类药物残留分析技术测定方法(一)

[db:作者] / 2022-12-13 00:00

8.1.4.2 测定方法

有关动物源基质中ASs残留检测方法的报道很多,主要是免疫分析法和色谱分析法。免疫分析法主要有酶联免疫测定法(ELISA)、放射免疫测定法(RIA)和胶体金免疫试纸法(GICA);色谱分析法主要有气相色谱法(GC)、气质联用法(GC-MS)、高效液相色谱法(HPLC)和液质联用法(LC-MS)。长期以来,GC-MS和ELISA一直是ASs残留分析的主要手段;但近年来,HPLC和LC-MS的应用越来越多,新的筛查技术(如分子生物学检测方法)也开始有研究报道。

(1) 气相色谱法(gaschromatography,GC)

GC以气体为流动相,用于残留药物的检测,具有高效能、高选择性、高灵敏度、分析速度快和应用范围广等特点。对于ASs残留分析,较早之前有过相关报道,但已逐渐被GC-MS方法取代。李青等建立了GC-ECD测定畜禽肉及内脏中雌二醇残留量的方法。采用乙醚和石油醚提取,旋转蒸干后,石油醚溶解残渣,甲醇-水(4+1,v/v)LLP净化,在吹干的试样残渣中加入1mL HFBA,超声20min,再用氮气吹干,加入0.5mL异辛烷,混匀后GC-ECD检测。色谱柱为SE-54,载气为氦气,进样口温度为290℃,检测器温度为300℃。方法LOD为0.5μg/kg,回收率为84.0%~93.0%。

(2)气相色谱-质谱联用法(gaschromatography-massspectrometry,GC-MS)GC-MS法是目前ASs残留检测中采用较多的方法。在各国颁布的标准方法中,GC-MS通常作为其最后的确证方法。ASs可以采用电子电离(EI)和化学电离(CI)的方式检测。

1)电子电离(EI)

Fritsche等建立了牛肌肉组织中雄激素、雌激素的GC-MS检测方法。极性ASs通过甲醇-水混合液提取后,用C18 SPE柱净化,而非极性ASs则需要氨基柱进一步净化,最后混合后用MSTFA-TMIS-DTE(1000+2+2,v/v)硅烷化衍生,GC-MS测定。分析柱为DB-5 mS毛细管柱,载气为氮气,进样口温度260℃,质谱接口温度290℃,EI源,电子能量为70eV,离子源温度为180℃。该方法LOD为0.02~0.1μg/kg,C19和C21甾类激素的添加回收率分别为56%~79%和54%~114%。Seo等用GC-MS同时测定了鸡肉中的雌二醇、睾酮等多种激素。样品经甲醇-水超声波提取,冷冻后过滤除脂,C18 SPE柱净化后,GC-MS测定。DB-1mS柱分离,载气为氦气,进样口温度为250℃,质谱接口温度为280℃,EI-SIM模式检测。方法LOD可达0.1~0.4μg/kg,合成和天然生长激素的总体回收率为68%~106%。Marchand等利用GC-MS检测肉中的23种ASs。通过LLP将ASs分为两类:含D4-3-酮类和酚结构类。两类化合物分别在60℃和室温,分别用MSTFA-TMIS-DTT和MSTFA-I2进行衍生,再用GC-MS测定。酚结构药物用MN-δ3柱分离,D4-3-酮类药物用OV-1柱分离,进样口温度为250℃。该方法的LOD为5~100ng/kg。陈捷等建立了不同动物肌肉组织中ASs残留的GC-MS检测方法。样品经组织捣碎、用β-葡糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶溶液酶解和超声提取后,用叔丁基甲醚萃取,再进行反相SPE净化,衍生化后进行GC-MS测定。采用DB-1毛细管柱分离,载气为He,不分流进样,进样口温度280℃,接口温度280℃,EI源,溶剂延迟10min。该方法LOD可达1.0~2.0μg/kg;在2.0μg/kg添加水平上,平均回收率可达62.5%~80.5%,RSD为12.5%~26.8%

Kootstra等建立了尿液中ASs多残留检测的GC-MS方法。采用了两种不同的衍生化试剂:HFBA和TMS,主要用于定性和半定量分析低剂量的ASs。质谱条件为:He为载气,FactorFourVF-17MS色谱柱分离,EI离子源,SIM模式检测,质谱源温度为250℃,四极杆温度为120℃,进样口温度分别为260℃(HFBA衍生化产物)和250℃(TMS衍生化产物)。该方法在添加浓度为1μg/L时,测得ASs的CCa为0.06~0.77μg/L,CCβ为0.09~0.46ug/L;添加浓度为2μg/L时,测得ASs的CCa为0.26~0.54μg/L,CCβ为0.44~0.92μg/L。

图8-4 19-去甲雄酮羰基衍生化反应及其产物

图8-5 19-去甲雄酮羟基衍生化反应及其产物

Yamada等报道了采用GC-MS/MS同时检测马尿中蛋白同化类固醇主要代谢物的方法。尿液经β-葡萄糖醛酸酶水解后,用Sep-Pak C18 PlusSPE柱净化,再经叠氮基三甲基硅烷衍生化后,GC-MS/MS离子源为EI源,在MRM模式下检测。该方法的LOD为5~50ng/mL,平均回收率和CV分别为71.3%~104.8%、1.1%~9.5%。Gaillard等采用GC-MS/MS方法检测了人头发中的ASs。采用甲醇提取,碱性水解后,再用乙酸乙酯提取,用氨基柱和硅胶柱进行SPE净化,MSTFA衍生化反应后,GC-MS/MS分析。CPSIL 8 CB色谱柱分离,载气为氦气,脉冲不分流进样,质谱接口温度为300℃,离子源温度为160℃,四极杆温度为70℃,初始炉温为80℃;EI电离,碰撞气为Ar。方法LOD小于等于6.2ng/g,平均添加回收率在61%~94%之间,日内CV小于15.2%。Rambaud等建立了人头发中ASs多残留检测方法。△4-3酮类化合物用MSTFA-TMIS-DTE(1000+5+5,v/v/w)衍生,群勃龙用MSTFA-I2衍生化,苯酚类固醇用MSTFA衍生后,GC-MS/MS分析。用0V-1毛细管柱分离,载气为He,脉冲不分流进样,质谱接口温度为320℃,碰撞气为Ar,EI电离后采用SRM模式分析。方法LOQ可达0.1~10μg/kg,平均回收率为50%。

Impens等建立了牛尿中ASs多残留的气相色谱-离子阱质谱(GC-MSn)检测方法。采用非极性BPX-5柱(25m×0.22mm,ID 0.25um)分离,氦气作为载气,程序升温,进样口温度为250℃,分流室气流速度为60mL/min,采取无分流进样模式;离子源温度200℃,传输线温度275℃,EI电离,离子化能量为70eV。当GC-Ms2分析时,测得17种ASs的CCβ为1~10μg/L;GC-MS3分析时,测得CCβ为2~10μg/L,可用于ASs常规检测。

2)化学电离(CI)

我国国家标准GB/T22967-2008采用GC-负化学电离源(NCI)-MS检测牛奶和奶粉中β-雌二醇残留量。样品经过β-葡糖苷酸酶和芳基硫酸苷酶水解和HLBSPE柱净化后,用五氟苯甲酰氯衍生化(60℃放置15min),再用GC-NCI-MS在SIM模式下测定,色谱柱为HP-5MS(30m×0.25mm,0.25um),载气为氦气,梯度洗脱,流速1.0mL/min,选择离子监测,进样量1μL,D4-B-雌二醇为内标定量。牛奶的LOD为0.25μg/kg,奶粉的LOD为2μg/kg。GB/T20749-2006采用类似的方法测定了牛尿中的β-雌二醇。

动物源基质中ASs的部分GC-MS残留检测方法见表8-5。

表8-5 动物源基质中ASs的部分GC-MS残留检测方法

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