非甾类同化激素类药残留量测定方法（二）

时间：2023-03-25 03:35:30来源：food栏目：食品快速检测阅读：

非甾类同化激素类药残留量测定方法（二）

[db:作者] / 2022-12-13 00:00

(5)高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)

HPLC是残留分析的国际公认方法，选择性强、灵敏度高。但是，因为样品前处理步骤较多，操作繁琐，分析时间长，不宜于残留检测的快速筛选。近年来，在HPLC基础上发展起来的超高效液相色谱(ultra performance liquid chromatography，UPLC)，是基于小颗粒填料的一种创新技术，它同时实现了高分离度、高灵敏度和高分析速度，目前也已经应用于非甾类同化激素的残留分析。非甾类同化激素HPLC检测主要采用紫外检测器(ultraviolet detector，UVD)、二极管阵列检测器(diode-array detector，DAD；photo-diode array detector，PDA)、荧光检测器(fluorescence detector，FLD)、蒸发光散射检测器(evaporative light scattering detector，ELSD)以及电化学检测器(electrochemical detector，ECD)等。

1)UVD，DAD/PDA

UVD是HPLC方法中常用的检测器。非甾类同化激素的分子结构中含有酚羟基和碳碳双键、酮基及酚羟基组成的长共轭体系，可以溶于稀碱溶液，在240～300nm有较强的UV吸收。

刘宏程等建立了HPLC-UVD法分析牛奶中DES、HES和DIS。采用MSPD技术提取和净化，以20mmol/L磷酸-乙腈(42+58，v/v)为流动相，在Xterra C18(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱上分离；或者，以20mmol/L磷酸-乙腈(60+40，v/v)为流动相，在HypersilC18(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱上分离；流速1.0mL/min，柱温30℃，进样20μL，紫外波长230nm检测。3种雌激素的平均回收率为84.1%～93.5%，RSD为3.5%～7.8%；DES、HES和DIS的LOD分别为0.004mg/kg、0.004mg/kg和0.006mg/kg，LOQ分别为0.01mg/kg、0.01mg/kg和0.02mg/kg。

张清杰等采用HPLC-UVD法检测牛奶和奶粉中的ZER、TAL、ZAN、ZON、ax-ZOL和β-ZOL。样品用乙腈提取，IAC柱净化，HPLC-UVD检测。色谱柱为Cloversil-C18(4.6mm×250mm)，流动相为乙腈～甲醇-水(43+7+50，v/v)，流速为0.80mL/min，柱温为室温，波长为265nm，进样量为20μL。牛奶和奶粉中ZER、TAL、ZAN、ZON、a-ZOL和β-ZOL的添加回收率均为80%～110%，CV均小于12%；牛奶的LOD为2.0μg/L，奶粉的LOD为0.4μg/kg。方晓明等建立了HPLC-UVD测定鸡肝中ZER的方法。样品经β-葡糖苷酸酶水解，乙醚提取，氢氧化钠抽提，C18固相萃取柱净化后，用Zorbax SB-Pheny1柱(250mm×416mmi.d.，5μm)分离，以乙腈-0.3%三氟乙酸水溶液(40+60，v/v)为流动相，流速为0.80mL/min，柱温为室温，进样量为10μL，262nm波长处检测。方法平均回收率为72.0%～80.4%，CV为8.3%～13.9%，LOQ为5μg/kg。

Koole等报道了采用HPLC-DAD同时测定牛尿中20种同化激素(包括二苯乙烯类和RALs)的分析方法。用RP-Select B色谱柱分离，乙腈-水为流动相，梯度洗脱，乙腈比例按照凹形曲线由43%上升到76%，各药物获得良好分离。以标准溶液校正的保留时间和UV光谱图定性，降低了标准偏差原始值的约25%。方法LOD在5～10ng之间。

2)FLD

FLD具有较强的选择性和较高的灵敏度，是残留分析中常采用的检测器。DES等二苯乙烯类需要衍生化才可以用FLD检测，文献报道很少；RALs中只有ZON、a-ZOL、β-ZOL可以用FLD检测。

Chen等等采用4-(4，5-diphenyl-1Himidazol-2-yl)benzoyl chloride (DIB-Cl)为衍生化试剂，建立了尿液中DES的HPLC-FLD检测方法。0.5mL尿液样品中加入0.05mL浓盐酸，80℃水解60min，待室温后加入200mL 3mol/L NaOH中和，C18柱净化，3mL乙酸乙酯洗脱，40℃水浴中氮气吹干，200uL乙酸乙酯复溶，再加入200μL 2.5mmol/L DIB-CI乙腈溶液和3μL 3mol/L三乙胺乙腈溶液于40℃衍生化30min，用20μL 1mol/L hCl溶液终止反应，取20μL hPLC分析。C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)分离，流动相为甲醇-水(96+4，v/v)，流速为1.0mL/min，采用程序荧光检测：0～8.5min，激发波长(λex)为200nm、发射波长(λem)为300nm；8.5～20min，λex为350nm、λem为460nm。结果，DES的LOD为0.5ng/mL，回收率为78.5%～88.3%，CV低于6.4%。

Shin等建立了HPLC-FLD方法检测老鼠血清中的ZON。血清样品经叔丁基甲基醚提取，HPLC-FLD分析，以为乙腈-0.1%三乙胺溶液(pH6，50+50，v/v)为流动相，在C18色谱柱(250mm×4.6mmi.d，5μm)上分离，λex和λem分别为246nm和460nm。该方法回收率为79.3%～96.2%，日内和日间CV低于12.1%，LOQ为10ng/mL。

3)ELSD

ELSD是一种通用型的检测器，可检测挥发性低于流动相的任何样品，而无需发色基团。ELSD的响应值与样品的质量成正比，因而能用于测定样品的纯度或者检测未知物。ELSD灵敏度比示差折光检测器高，对温度变化不敏感，基线稳定，适合于HPLC梯度洗脱。

江勇等建立了HPLC-ELSD检测肉产品中DES等药物的残留分析方法。称取样品5g于具塞三角瓶中，加甲醇10.0mL，超声处理10min，取上清液离心后用HPLC-ELSD分析。经试验确定HPLC和ELSD的条件：色谱柱Diamonsil TM C18 ODS(250mm×4.6mm.i.d，5um)，流动相为5%乙酸和乙腈，梯度洗脱，流速1.0mL/min，进样量10μL，柱温30℃；ELSD增益值为7，温度40℃，载气为空气，压力3.4bar。按信噪比(S/N)为3计算，该方法DES的LOD为0.0058mg/kg，回收率为85.2%，CV为3.18%。

4)ECD

ECD是测量物质的电信号变化。具有氧化还原性质的化合物，如含硝基、氨基等有机化合物以及无机阴、阳离子等物质，均可采用ECD检测。ECD又包括极谱、库仑、安培和电导检测器等，前三种统称为伏安检测器，用于具有氧化还原性质化合物的检测，而电导检测器主要用于离子检测。

Reuvers等用HPLC-ECD检测动物可食用组织中的DES残留。组织样品先用叔丁基甲醚提取，1mol/L氢氧化钠再次提取，用C18固相萃取柱净化，以甲醇-0.05mol/L磷酸缓冲液(pH3.5)(67+33，v/v)为流动相，在Nucleosil C18色谱柱分离，ECD在+0.90V检测。该方法LOD为0.5～2.0μg/kg，回收率为66%。万美梅等建立了动物组织中DES的HPLC-ECD检测方法。色谱柱为Hypersil ODS C18柱(5um，4.6mm×250mm)，流动相为乙腈-0.007mol/L磷酸二氢铵(48+52，v/v，pH3.5)，柱温为32℃，流速为1.0mL/min。ECD参数设置：模式为前处理(pretreat)，工作电位0.9V，前处理控制设为停止，零点控制设为准备，后时间30min，前处理循环8次，前处理电位1为1.4V，前处理电位2为-0.4V，前处理时间1为200ms，前处理时间2为300ms，前处理时间3为500ms，峰宽0.10min，电极为氧化电极，仪器灵敏度0.5μA。DES浓度在0.2～100ng/g范围内具有良好线性关系，相关系数为0.9995；各组织不同添加浓度的平均回收率均为80%，日内CV小于3.60%，日间CV小于3.72%；LOD为0.2ng/g。

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