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吡唑酮类药残留测定——高效液相色谱法

时间:2023-03-25 00:51:32来源:food栏目:食品快速检测 阅读:

 

吡唑酮类药残留测定——高效液相色谱法

[db:作者] / 2022-12-20 00:00

(6)高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)

本类药物的吡唑酮结构具有紫外吸收特性,HPLC分析主要采用反相色谱分离,紫外检测器(ultraviolet detector,UVD)测定。

1)酸性药物

庞国芳等采用反相HPLC测定了动物肌肉中的保泰松。以0.05 mol/L乙酸铵溶液-甲醇-乙腈(53+35+12, v/v) 为流动相,流速0.8 mL/min, C18 色谱柱分离,柱温40℃,检测波长270 nm。猪肉、牛肉、鸡肉、羊肉的回收率在75%~105%之间,RSD在4.0%~10.0%之间,LOD为5 μg/kg。作者对流动相配比进行试验发现,减少甲醇比例,杂质峰的数量显著增加,逐渐出现较大的干扰峰,直至淹没样品峰;减少乙腈的比例,灵敏度会减小,与杂质峰的分离度降低,峰形和回收率又逐步降低,但与样液中的干扰物能完全分开。

Neto等采用HPLC-UVD测定血液中的保泰松和羟布宗。净化后的样品采用Chrospher RP-18 色谱柱分离,流动相为0.01 mol/L乙酸-甲醇(45+55, v/v), 流速1 mL/min,检测波长为254 nm。方法回收率为83%~105%, CV为4.7%~7.8%,保泰松的LOD为0.5 μg/ml,羟布宗为1.0 μg/mL。Grippa等建立了同时测定马血液中保泰松、羟布宗等4种药物的HPLC方法。色谱分离选用C18色谱柱,流动相采用乙腈-水(含0.1%三氟乙酸和0.1%三乙胺)(51+49, v/v),流速1 mL/min,检测波长254 nm。保泰松、羟布宗的回收率分别为51.5%±2.7%和 37.9%±0.9%, CV分别为5.5%~ 14.8%和2.7%~13.6%;保泰松LOD为0.5 μg/mL,羟布宗为1 μg/mL。Marti 等采用乙腈提取血浆中的保泰松,上清液直接进HPLC分析。色谱柱采用chrospher 60 RP (150 mm×4.6mm,5um),流动相为0.01mol/L乙酸-甲醇(35+65,v/v), 流速1mL/min,检测波长240nm。方法回收率为83%,LOD和LOQ分别为0.016ug/mL和0.029μg/mL。Taylor等采用 HPLC测定马血液中保泰松和羟布宗。色谱柱为Hypersil C18(100mm×4.6mm,5um),流动相为甲醇-0.1%乙酸溶液(6+4,v/v),流速1.5mL/min,检测波长240 nm。保泰松和羟布宗的回收率分别为53.5%~63.1%和43.3%~47.2%;CV分别为5.1%和4.0%,LOQ为10μg/mL。De Veau测定牛血浆中游离的保泰松,血浆经过分子滤过膜滤去分子量大于10000的杂质后,离心取上清,进HPLC测定。色谱柱为反相C18(250mm×4.6mm,5μm),流动相为0.2mol/L磷酸钠缓冲液-甲醇(1+1,v/v),流速1mL/min,检测波长264nm。方法回收率为91%~93%,CV为1%~4%,LOQ为2 μg/mL。Caturla等将血液提取液蒸干后,用甲醇复溶,反相色谱C18(250mm×4.6mm,5μm)分离,流动相采用pH3的0.02mol/L硫酸铵-乙腈(45+55,v/v),流速为1mL/min,检测波长240nm。保泰松和羟布宗的LOQ均为0.05μg/mL,回收率大于90%。Marunaka等测定血液和尿液中的保泰松、羟布宗,样品用盐酸酸化后,萃取至苯-环已烷(1+1,v/v)溶液,萃取液吹干后复溶于甲醇,进HPLC测定。色谱柱为C8(30cm×4mm,10μm),流动相为甲醇-0.01mol/L乙酸铵,梯度洗脱,流速2.0mL/min,检测波长254nm。保泰松、羟布宗和y-羟基保泰松的LOD均为0.05μg/mL,保泰松、羟布宗的回收率分别为96.7%±1.7%和93.1%±3.7%。

Haque等将 血浆直接注入HPLC系统测定保泰松和羟布宗。采用半通透表面色谱柱5PM-S5-100-C18 (15 cm×4.6 mm)分离,流动相为乙腈磷酸盐缓冲液(15+85,v/v), 流速1 mL/min,检测波长270nm。该方法线性范围为0.5~20ug/mL,CV小于6%,保泰松和羟布宗的LOQ和LOD分别为0.5ug/mL和0.25μg/mL,分析时间小于13min。半通透性表面色谱柱可多次进血清样品,色谱柱含有两种作用机制的固定相,外层为多孔水溶性的聚氧乙烯共价结合在硅胶基质上,内层为脂溶性C18、C8、氰基和苯基。半通透性表面色谱柱流动相中有机溶剂含量应低于25%,pH为5.5~7.5,溶液中盐分含量应在0.05~0.1mol/L之间,以防样品中蛋白质沉淀。该方法非常简单,血清样品可直接进HPLC测定。

2)碱性药物

Katz等建立了测定血浆中安乃近4种代谢物的HPLC方法。样品用氢氧化钠溶液碱化后,用二氯甲烷提取,提取液蒸干,流动相复溶,HPLC测定。色谱柱为PBondapak C18 柱(300mm×3.9mm),流动相为甲醇-0.01mol/L乙酸钠溶液(用盐酸调节pH3.0)(8+92,v/v),流速1.6mL/min,检测波长257nm,用异丙基氨基安替比林为内标定量。FAA和AAA的校正回收率为96.0%~100%,MAA和AA为70.6%~87.8%,CV均低于6.7%;LOD均为0.1μg/mL。王章阳等建立了同时测定兔血浆中安乃近及其3种代谢物(FAA、AA和MAA)的HPLC方法。以2-萘-磺酸钠为内标,pH6.5的。甲醇-水-磷酸盐缓冲液(35+63+2,v/v)为流动相,采用ODS(15mm×6mm)分析柱分离,流速1.0mL/min,柱温35℃,检测波长260nm。FAA、AA和MAA平均回收率均接近100%,LOD均为0.15μg/mL。崔景斌等用HPLC测定血浆中的安乃近代谢物MAA。内标物为异丙氨基安替比林,色谱柱为YWG-C18柱(150mm×5mm),流动相为pH5.5磷酸盐缓冲液-甲醇(68+32,v/v),流速2mL/min,检测波长254nm。MAA的绝对回收率为82.5%,相对回收率为99%,CV小于3.66%,检测LOQ为0.05μg/mL。

沈金灿等建立了牛和猪肌肉中安乃近代谢物FAA、AA和MAA的HPLC测定方法。采用Inertsil ODS3色谱柱分离,水和甲醇为流动相,梯度洗脱,流速1mL/min,检测波长265nm。FAA的回收率为81.3%~92.5%,AA的回收率为82.0%~96.0%,MAA的回收率为80.4%~90.6%;RSD均在7%以内;LOQ均为50.0μg/kg。研究发现,流动相pH低于7.0时,随着pH的降低,各组分在反相色谱柱上的保留降低。虽然各组分分离度并没有明显的降低,但由于保留时间的缩短容易引起目标组分与干扰组分共洗脱,从而影响目标物的测定。同时,在相同的梯度条件下,用甲醇时的保留时间比用乙腈的保留时间长,这使得FAA能够与干扰组分实现良好的分离。另外,在中性条件下,不同的水相流动相(20mmol/L醋酸铵溶液、20mmo/L磷酸盐溶液和纯水)对目标物的分离没有显著的影响,但采用缓冲液体系进行梯度洗脱时,基线会随着含水量的变化产生较大的波动。我国国家标准GB/T20747-200651也采用InertsilODS3色谱柱分离,以水-甲醇为流动相,梯度洗脱,流速1mL/min,265nm波长处测定FAA、MAA和AA。方法LOD在12.5~20ug/kg之间,定量范围为50~400ug/kg,回收率为80%~96%。

MikatimA等建立了测定尿液中安替比林及其代谢物的HPLC方法。尿液酶解后,用乙酸乙酯提取,提取液蒸干后用流动相复溶,进HPLC测定。色谱柱为反相C18柱(30cm×3.9mm),流动相为含7.5%乙腈的0.1mol/L乙酸钠溶液(用乙酸调节pH6.6),流速3.5mL/min,柱温35℃,检测波长254nm。安替比林、NORA、OHA、HMA的回收率在97%~105%之间,CV小于5%,LOQ低于3μg/mL。

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