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液相色谱-串联质谱法测定牛、猪肝脏和肌肉中卡巴氧和喹乙醇及代谢物残留量

时间:2023-03-24 23:53:59来源:food栏目:食品快速检测 阅读:

 

液相色谱-串联质谱法测定牛、猪肝脏和肌肉中卡巴氧和喹乙醇及代谢物残留量

[db:作者] / 2022-12-21 00:00

15.2.1.1 适用范围

适用于牛、猪肌肉和肝脏中卡巴氧及其代谢物脱氧卡巴氧、喹噁啉-2-羧酸和喹乙醇代谢物3-甲基喹噁啉-2-羧酸残留量的液相色谱-串联质谱测定。方法检出限:卡巴氧、脱氧卡巴氧、喹噁啉-2-羧酸和3-甲基喹噁啉-2-羧酸均为0.5ug/kg。

15.2.1.2 方法原理

用乙腈+乙酸乙酯(1+1,v/v)溶液提取肌肉和肝脏组织中的卡巴氧,提取液经正己烷脱脂后,旋转蒸发至干,残渣用甲酸(0.1%)+甲醇(19+1,v/v)溶液溶解。样液供液相色谱-串联质谱仪测定,内标法定量。用甲酸溶液消化试样,使组织中天然存在的酶失活,然后加入蛋白酶水解,盐酸酸化,离心过滤后,过Oasis MAX固相萃取柱或相当者净化。先用二氯甲烷洗脱脱氧卡巴氧,再用2%甲酸乙酸乙酯溶液洗脱喹噁啉-2-羧酸和3-甲基喹噁啉-2-羧酸,氮气吹干洗脱液,残渣用甲酸+甲醇(19+1,v/v)溶液溶解,样液供液相色谱-串联质谱仪测定,内标法定量。

15.2.1.3 试剂和材料

甲醇、乙腈、甲酸:色谱纯;正已烷、乙酸、浓盐酸、乙酸钠、二甲基甲酰胺、乙酸乙酯:分析纯;中性氧化铝:200~300目:乙腈+乙酸乙酯溶液:(1+1,v/v)。

甲酸乙酸乙酯溶液:2%。向400mL乙酸乙酯中加入10mL甲酸,用乙酸乙酯定容至500mL;甲酸溶液:0.6%。量取6.0mL甲酸,用水溶解、定容至1L;甲酸溶液:0.1%。量取1.0mL甲酸,用水溶解、定容至1L;甲酸+甲醇溶液:(19+1,v/v)。用190mL甲酸溶液与10mL甲醇混合;盐酸溶液:0.1mol/L。量取8.3mL浓盐酸,用水溶解、定容至1L;盐酸溶液:0.3mol/L。量取25mL浓盐酸,用水溶解、定容至1L;Protease蛋白酶:Sigma P5147 或相当者,-18℃以下保存;蛋白酶水溶液:0.01g/mL。称取1.00g Protease蛋白酶,用水溶解、定容至100mL,4℃保存;乙酸溶液:10%。量取100mL甲酸,用水溶解、定容至1L;乙酸钠溶液:0.05mol/L,pH=7。称取6.8g乙酸钠用800mL水溶解,再滴加10%乙酸溶液以调节溶液pH=7,用水定容至1L;乙酸钠+甲醇溶液:(19+1,v/v)。用190mL乙酸钠溶液与10mL甲醇混合;甲醇+水溶液:(1+4,v/v);Tris碱:Sigma T1503或相当者;Tris溶液:1.0mol/L。称取121 g Tris碱,用水溶解、定容至1L,4℃保存。卡巴氧、脱氧卡巴氧、喹噁啉-2-羧酸、3-甲基喹噁啉-2-羧酸、喹噁啉-2-羧酸-d4标准物质:纯度≥99%。

标准储备溶液:100mg/L。准确称取适量标准物质,卡巴氧用二甲基甲酰胺溶解定容,其余标准物质分别用甲醇溶解定容,配成100mg/L的标准储备液,在-18℃保存,可使用1年。

基质混合标准工作溶液:根据灵敏度和使用需要,用空白样品提取液配成不同浓度(μg/L)的基质混合标准工作溶液,在4℃保存,可使用1周。

内标工作溶液:准确称取适量内标标准物质,用甲醇溶解定容,配成100μg/L的标准工作溶液,在4℃保存,可使用1周。

阴离子交换柱: Oasis MAX 60mg,3mL,或相当者。用前分别用3mL甲醇和3mL水活化,保持柱体湿润。

15.2.1.4 仪器和设备

液相色谱-串联质谱仪:配有电喷雾离子源;固相萃取装置;氮气浓缩仪;液体混匀器;分析天平:感量0.1mg和0.01g;真空泵;均质器;移液器:10~100uL和100~1000uL;聚丙烯离心管:50mL,具塞;pH计:测量精度±0.02pH单位;低温离心机:可制冷到4℃;玻璃离心管:15mL。

15.2.1.5 样品前处理

(1)试样制备

将牛、猪肝脏和肌肉组织样品充分搅碎,均质,分出0.5kg作为试样,置于清洁样品容器中,密封,并做上标记。将制备好的试样于-18℃以下保存。

(2)卡巴氧的前处理步骤

称取5g试样,精确至0.01g。置于50mL聚丙烯离心管中,加入5g中性氧化铝。加入25mL乙腈+乙酸乙酯溶液,于液体混匀器上充分混合5min,以5000r/min离心5min,将上清液移取至另一干净的50mL离心管,加入10mL正已烷到管内,振荡2min,以5000r/min离心5min,弃去上层正已烷,将下层清液转移至150mL鸡心瓶中。

重复上述步骤一次, 合并2次提取液于同一鸡心瓶中,加入一定量的喹噁啉-2羧酸-d4标准溶液,使其浓度为2.0ng/g,40℃水浴,减压旋转蒸发至干。准确加入1.0mL甲酸+甲醇溶液溶解残渣,过0.2um滤膜后,供液相色谱-串联质谱仪测定。

(3)脱氧卡巴氧、喹噁啉-2-羧酸、3-甲基喹噁啉-2-羧酸的前处理步骤

称取5g试样,精确至0.01g。置于50mL聚丙烯离心管中,加入10mL 0.6%甲酸溶液,混匀后,置于47℃±3℃振荡水浴中振摇1h;先加入3mL 1.0mol/L Tris溶液混匀,再加入0.3mL蛋白酶溶液,充分混匀后,置于47℃±3℃振荡水浴中酶解16~18h。加入20mL 0.3mol/L HCI,振荡5min,在10℃以5000r/min离心15 min,上清液过滤。 将滤液移入Oasis MAX固相萃取柱中,待样液全部流出后,用30mL乙酸钠+甲醇溶液淋洗固相萃取柱,真空抽干15 min。在- - 支干净的玻璃管内加入一定量的喹噁啉-2羧酸-d4标准溶液,使其浓度为2.0ngg,再用4×3mL二氯甲烷将脱氧卡巴氧洗脱至管内,在45℃用氮气浓缩仪吹干。固相萃取柱再用3×3mL甲醇、3mL水、3×3mL 0.1mol/L盐酸和2×3mL甲醇+水溶液溶液分别淋洗,真空抽干15min,然后用2mL乙酸乙酯再淋洗固相萃取柱,弃去全部淋出液,最后用3mL甲酸+乙酸乙酯溶液洗脱喹噁啉-2-羧酸和3-甲基喹噁啉-2-羧酸至试管中,在45℃用氮气浓缩仪吹干。准确加入1.0mL 0.1%甲酸+甲醇溶液溶解残渣,过0.2um滤膜,供液相色谱-串联质谱仪测定。

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