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苯并咪唑类药物测定——生物学方法

时间:2023-03-24 23:10:22来源:food栏目:食品快速检测 阅读:

 

苯并咪唑类药物测定——生物学方法

[db:作者] / 2022-12-21 00:00

17.1.4.2 测定方法

BMZs的测定方法主要有生物学方法、免疫检测法和仪器检测法。生物学方法和免疫检测方法快捷、简便、灵敏,但易产生较高的假阳性率,仅作为筛选方法。仪器检测法主要是色谱技术与通用检测器,如紫外检测器(UVD)、荧光检测器(FLD)或质谱(MS)联用,是目前BMZs残留分析的主要技术手段。其中,MS是欧盟2002/657/EC决议中规定使用的确证方法,可进行定性、定量检测。

(1)生物学方法

生物学测定BMZs的方法主要用于日常评估食品中潜在的驱虫药。生物学测定通常的做法是,首先在薄层色谱(TLC)平板上分离残留物,然后在平板上依次喷上营养琼脂和含有指示生物的溶液,若TLC平板上出现抑制带,则表明有BMZs残留,抑制带的大小与BMZs残留的浓度相关。Rew等建立了一种用猪蛔虫幼虫多孔筛选分析TBZ、ABZ、ABZ-SO、ABZ-SO2和MBZ的方法。不同的药物和浓度对不同发育阶段(L2~L4)幼虫的作用不同,L2确定为幼虫的虫卵孵化阶段,L3为第一次蜕皮,L4为第二次蜕皮。所有药物残留物在10ng/mL时能够抑制L2~L3阶段的幼虫,L3~L4阶段的幼虫也能被BMZs抑制。这种幼虫抑制与BMZs的类型和浓度高度相关。ABZ、MBZ、TBZ、ABZ-SO和ABZ-SO2的抑制浓度分别为10ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、100ng/mL和1000ng/mL。生物分析方法作为食品中BMZs残留检测的筛选方法是较廉价的,但试验生物对BMZs代谢物或残留标示物敏感性的变化是关键问题,还需要进-一步研究。

(2)免疫分析法(immunoasay,IA)

免疫分析方法简单、灵敏、选择性好,常用于测定生物基质中BMZs残留。在某些情况下,采用免疫学方法分析血浆、血清和牛奶等样品,可以直接测定或稀释后测定。目前采用的免疫分析主要有放射免疫分析法、酶联免疫法和免疫传感器方法。

1)放射免疫分析法(radioimmunoassay,RIA)

RIA早期被用于测定动物组织中BMZs残留。Nerenberg等建立了测定血浆中OFZ残留的RIA分析法。在水溶性碳化二亚胺偶联剂(EDC:HCI)中,将OFZ通过碳化二亚胺反应偶联到聚赖氨酸载体,免疫兔子,制备多克隆抗体。将缓冲液、标记物、标准品、未知物、抗血清等加入试管中漩涡混合,密封后在水浴40℃下过夜孵化,降温后进行添加,离心,取上清液转移至闪烁瓶,加入闪烁液,用闪烁光谱仪进行液体闪烁计数。该方法的LOD为200pg/mL,重复试验的标准误差(SD)为5%。

2)酶联免疫分析法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)

近年来,ELISA逐渐取代了RIA,在BMZs残留分析中得到了广泛应用。Brandon等将TBZ和TBZ-5-OH偶联到牛血清白蛋白(BSA)上制备免疫原,免疫小鼠产生单克隆抗体,建立了测定肝组织中TBZ的竞争性ELISA法。虽然用TBZ-5-OH偶联物制备的抗体特异性低,但对CAM和TBZ-NH2显示出很好的交叉反应性能;研究发现抗体对BMZs的交叉反应性并不在噻唑环上,所以对ABZ、MBZ和FBZ交叉反应较小。该方法LOD小于20ng/mL,平均回收率为97%,CV为17%。随后,该作者又用琥珀酰胺连接ABZ到BSA载体蛋白,免疫小鼠,制备出了单克隆抗体,对11种氨基甲酸酯类BMZs显示出很好的交叉反应性,包括ABZ、FBZ、OXI、MBZ、FLU、MBZ和一些代谢物,但对噻唑类BMZs(TBZ、CAM和TBZ-5-OH)没有交叉反应。该ELISA方法对ABZ及其代谢物的LOD为58ug/kg。Moran等采用新的免疫原(5-苯并咪唑羧酸)偶联到脂肽Pam;Cyst-TH制备出鼠单克隆抗体,这种抗体能够用来建立测定组织中与蛋白结合的TBZ代谢物的ELISA方法,但没有实际应用的介绍。陈飞等应用竞争ELISA技术,建立了一种快速检测动物组织中BMZs多残留的方法,并对其技术性能进行了评价。该方法的半数抑制浓度(IC50)浮动范围为0.9~1.5μg/L,动物组织样本的LOD为8μg/kg;样本添加回收率为79.8%~100.5%,CV为7.2%~9.5%。

3)表面等离子体共振技术(surface plasmon resonance,SPR)

表面等离子共振技术是20世纪90年代发展起来的一种生物分子检测技术,是基于SPR检测生物传感芯片上配体与受体相互作用的一种传感器技术,是利用金属膜/液面界面光的全反射引起的物理光学现象来分析分子相互作用。SPR传感器与传统检测手段比较,具有无标记,实时监测,灵敏度高等突出优点。所以,在医学诊断,生物监测,生物技术,药品研制和食品安全检测等领域有广阔的应用前景。

Keegan等建立了牛奶中11种氨基甲酸酯类BMZs残留的SPR检测方法。该方法采用多克隆抗体建立,该抗体是由5(6)-羧戍基硫基-2-苯并咪唑氨基甲酸酯蛋白偶联物制备的。前处理方法采用改进的QuEChERS方法。该方法的LOD为2.7ug/kg,11种药物的平均回收率为81%~116%。该作者还建立了两种SPR筛选方法,检测肝脏组织中11种氨基甲酸酯类BMZs和4种氨基BMZs兽药残留。方法基于羊多克隆抗体,样品用乙腈提取,氨基甲酸酯类BMZs用C18吸附剂净化,氨基BMZs直接用环已烷除脂净化,SPR测定。氨基甲酸酯类BMZs的LOD为32ug/kg,平均回收率为77%~132%;氨基BMZs的LOD为41μg/kg,平均回收率为103%~16%。Johnsson等也将5(6)-羧戊基硫基-2-苯并咪唑氨基甲酸酯蛋白偶联物制备的多克隆抗体用于SPR分析,测定牛血清中BMZs残留。该方法显示对ABZ、FBZ-SO2、MBZ、FBZ和OXI等5种BMZs具有较好的交叉反应性(>74%)。用20个空白血清样品测定的LOD和LOQ分别为2.6和4.8μg/kg。研究评估了不同样品处理方法对传感器响应的影响,发现用没有沉淀蛋白的血清制备的标准曲线,同用缓冲溶液制备的标准曲线并不一致。

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